Mikroorganisme yang ada di alam ini
mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri.
Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel
bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati
bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri,
sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan
sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi.
Struktur di dalam sel pada
tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora. Endospora
dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas,
kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan
oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan
dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan
panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali
pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora
di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan
spesies-spesies bakteri yang membentuknya.
Faktor-faktor yang mempengaruhi
pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap
suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.
sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.
Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan
ciri yang khas bagi suatu spesies.
Teknik pewarnaan warna pada bakteri
dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan
negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada
bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu
pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara
sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan
diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari
sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan
ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.
Macam-macam pewarnaan:
1. Pewarnaan negatif
- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang
- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang
- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
Cara pewarnaan negatif
- Sediaan hapus → teteskan emersi →
lihat dimikroskop
Pewarnaan negatif, metode ini bukan
untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.
Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik
ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini
olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan
kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan sedehana
- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel
- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel
Pewarnaan sederhana, merupakan
pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri
(kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan
pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam
zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan
zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif).
3. Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri
tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-asam, dan penggunaan pembalik
warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna merah.
4. Pewarnaan structural/khusus
- Untuk mewarnai struktur
khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll
i)
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan
Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan
menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air
dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang.
Yang berwana biru gelap.
ii)
Pewarnaan spora
Dinding spora relative tidak
permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.
iii)
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi
suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk
presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
iv)
Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna
fuelgen yang khusus untuk DNA.
5. Pewarnaan diferensial
- menggunakan lebih dari satu macam
zat warna
- Tujuan untuk membedakan antar
bakteri
- Contoh: Pewarnaan Gram, Pewarnaan
Bakteri Tahan Asam
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk
memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk
bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding
sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan
sekitarnya.
Pewarnaan Gram atau metode Gram
adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik
dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram,
bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram
negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi
atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh
karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong
bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies
tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki
sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga
menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna
yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan
biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Zat warna adalah senyawa kimia
berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion
bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna
untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar
pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam
dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat
warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam.
Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan
lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO.
Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan
bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan
bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti
: fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat
warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan
bakteri gram negatif berwarna merah.
Dalam pewarnaan gram diperlukan
empat reagen yaitu :
- Zat warna utama (violet kristal)
- Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
- Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
- Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri
yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram.
Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci
dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram,
suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang
membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4
tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Pada proses pewarnaan gram, harus
gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas
lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol . Setelah di
cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur
bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur
bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit
diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka
bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu
per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan
fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan
supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri
tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam
proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena
nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet
dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering
(dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi
kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci
dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu
kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci
kembali dengan air mengalir. Kemudian dicuci dengan etanol dan dicuci kembali
dengan air mengalir.
Pewarnaan selanjutnya dengan
menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering
dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop.
Pemberian kristal violet pada
bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon
terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur
dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan
gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya
tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan
terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan
safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada
bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.
Perbedaan dasar antara bakteri gram
positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin
terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram
positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram
positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal
(25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan
Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa
perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri
Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
-
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau
multilayer.
-
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
-
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering,
tidak mengandung asam tekoat.
-
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
-
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal
violet.
-
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
-
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
-
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
-
Peka terhadap streptomisin
-
Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
-
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
monolayer.
-
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada
yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat
ringan. Mengandung asam tekoat.
-
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
-
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
-
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
-
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
-
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
-
Tidak peka terhadap streptomisin
-
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Tidak ada komentar:
Posting Komentar